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原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作要注意的事項(xiàng)

更新時(shí)間:2022-09-06      點(diǎn)擊次數(shù):1147
  原代細(xì)胞(primaryculturecell)是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究,如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學(xué)研究等,還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。
  細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過(guò)物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例;化學(xué)介導(dǎo)方法很多,如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù);生物介導(dǎo)方法,有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。
  原代細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作要注意的事項(xiàng):
  1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備
  ①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。
  ②震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。
  2.選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。
  3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。
  4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。
  5.加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。
  6.到時(shí)后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。
  三、第二次細(xì)胞傳代
  1.在轉(zhuǎn)染后24小時(shí),觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。
  2.再次進(jìn)行細(xì)胞傳代,按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。
  3.在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。
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